Un'unità militare d'élite composta da agenti speciali noti come G.I. Joe, che opera dalla Fossa, affronta un'organizzazione malvagia guidata da un famigerato trafficante d'armi. Dal deserto egiziano alle profondità delle calotte polari, la squadra d'élite dei G.I. JOE utilizza le più recenti attrezzature militari e di spionaggio di ultima generazione per combattere il corrotto trafficante d'armi Destro e la crescente minaccia della misteriosa organizzazione Cobra e impedire che facciano precipitare il mondo nel caos.
Dopo che le bozze trapelate della sceneggiatura sono state criticate dai fan, Larry Hama, scrittore del fumetto, è stato assunto come consulente creativo e sono state effettuate delle riscritture. Le riprese si sono svolte a Downey, in California, e ai Barrandov Studios di Praga, mentre sei società si sono occupate degli effetti visivi.
Il film è stato presentato in anteprima mondiale al Grauman's Chinese Theatre di Hollywood, in California, il 6 agosto 2009 ed è stato distribuito nelle sale di tutto il mondo il giorno successivo, dopo un'ampia campagna di marketing incentrata sul pubblico medio-americano. L'ascesa di Cobra ha esordito al primo posto al botteghino e ha incassato oltre 302 milioni di dollari in tutto il mondo alla fine del suo ciclo, anche se l'accoglienza della critica è stata generalmente negativa. Un sequel, intitolato G.I. Joe: Retaliation, è uscito il 28 marzo 2013.
Nel 2019, il maestro d'armi James McCullen ha creato un'arma basata sulle nanotecnologie: i nanomiti sono progettati per divorare metallo e altri materiali, in grado di distruggere qualsiasi cosa, dai carri armati alle città. I nanomiti possono essere fermati solo attivando l'interruttore di sicurezza. La sua azienda M.A.R.S. vende quattro testate alla NATO e le truppe della NATO, guidate dai soldati americani Duke e Ripcord, vengono incaricate di consegnare le testate. Il loro convoglio subisce un'imboscata da parte della Baronessa, che Duke riconosce essere la sua ex fidanzata Ana Lewis. Duke e Ripcord vengono salvati dai corpi speciali Scarlett, Snake Eyes, Breaker e Heavy Duty. Portano le testate al Pit, il centro di comando dei G.I. Joe in Egitto, e al loro arrivo si incontrano con il capo della squadra G.I. Joe, il Generale Hawk. Hawk prende il comando delle testate e scaccia Duke e Ripcord, per poi convincerli a unirsi al suo gruppo dopo che Duke rivela di conoscere la Baronessa.
McCullen si scopre che sta usando la stessa nanotecnologia per costruire un esercito di soldati con l'aiuto del Dottore, progettando di usare le testate per provocare il panico mondiale e creare un nuovo ordine mondiale. Utilizzando un dispositivo di localizzazione, McCullen individua la base dei G.I. Joe e invia il ninja Storm Shadow e la Baronessa a recuperare le testate, con l'assistenza dello specialista dell'infiltrazione e spia Zartan.
Dopo un combattimento, Storm Shadow e la Baronessa recuperano le testate e le portano al Barone DeCobray, il marito della Baronessa, affinché le armi vengano utilizzate nel suo acceleratore di particelle; dopo averlo fatto con riluttanza, DeCobray viene ucciso da Storm Shadow. Dirigendosi verso Parigi, i Joe inseguono la Baronessa e Storm Shadow, ma non riescono a impedire loro di lanciare uno dei missili. Il missile colpisce la Torre Eiffel e rilascia i nanomiti in esso contenuti, distruggendo la torre e parte dell'area circostante prima che Duke riesca a premere l'interruttore di sicurezza. Tuttavia, nel farlo, viene catturato e portato nella base di McCullen sotto l'Artico, mentre i Joe devono essere espulsi dalla Francia, essendo stati incastrati per aver distrutto la Torre Eiffel.
I Joe, invece di tornare alla Fossa come ordinato, localizzano la base segreta e vi volano, mentre McCullen carica le tre testate rimanenti su tre missili, diretti a Pechino, Mosca e Washington, DC, le tre capitali più importanti del mondo. McCullen afferma che intende farlo perché, uccidendo milioni di persone in queste città, incuterà paura nei cuori di tutti gli uomini, le donne e i bambini del pianeta, che poi si rivolgeranno alla persona con il maggior potere al mondo, il Presidente degli Stati Uniti. Dopo che Snake Eyes ha abbattuto un missile, Ripcord distrugge gli altri due utilizzando un prototipo di jet Night Raven rubato al M.A.R.S., mentre Scarlett, Breaker e Snake Eyes si infiltrano nella base. Snake Eyes duella e prevale su Storm Shadow. Duke scopre che il Dottore, datore di lavoro di McCullen, è in realtà Rex Lewis, il fratello di Ana, che si ritiene sia stato ucciso da un attacco aereo sbagliato durante una missione guidata da Duke (che è anche l'origine dell'alienazione tra Duke e Ana). Rex aveva incontrato il Dr. Mindbender nel bunker ed era stato sedotto dalla tecnologia dei nanomiti, impiegando troppo tempo per recuperare i dati e rimanendo coinvolto nel bombardamento, che lo aveva sfigurato e costretto a indossare una maschera per aiutarlo a respirare. Dopo aver liberato Duke, la Baronessa viene soggiogata e il Dottore le rivela di averle impiantato dei nanomiti che l'hanno messa sotto il suo controllo negli ultimi quattro anni. Nel tentativo di uccidere Duke con un lanciafiamme, McCullen finisce per bruciarsi quando Duke spara all'arma e la fa esplodere, così Rex e lui fuggono verso una nave di salvataggio. Duke e la Baronessa lo inseguono mentre i Joe ripiegano dopo che Rex ha attivato la sequenza di autodistruzione della base, che prevede di "far saltare la calotta glaciale" per creare blocchi di ghiaccio che poi quasi schiacciano i Joe.
Rex assume l'identità del Comandante, dopo aver guarito il volto ustionato di McCullen con dei nanomiti, trasformando la sua pelle in una sostanza simile all'argento e dandogli il nome di "Destro", che pone McCullen sotto il controllo del Comandante. Subito dopo vengono catturati dai G.I. Joe. Sulla superportata USS Flagg, la Baronessa viene messa in custodia protettiva fino a quando non riusciranno a rimuovere i nanomiti dal suo corpo. Nel frattempo, Zartan, il cui aspetto fisico è stato alterato dai nanomiti, si infiltra nella Casa Bianca durante la crisi missilistica e assume l'identità del Presidente degli Stati Uniti, completando così una parte del piano di McCullen per governare il mondo, ora come contendente del Comandante e leader ad interim di un M.A.R.S. riorganizzato, ora chiamato COBRA.